重组蛋白表达量低是蛋白制备过程中较常见的问题。目标基因成功构建到表达载体并不意味着能够获得足量的目的蛋白。蛋白表达实际受到基因序列、转录与翻译效率、宿主细胞、蛋白折叠、稳定性以及降解等多个环节共同影响。不同蛋白即使使用相同的表达载体和宿主也可能表现出完全不同的表达水平。判断低表达问题时不能简单地将原因归结为“表达系统效率低”。有些蛋白实际上已经大量合成但主要以包涵体或聚集体形式存在有些蛋白在合成后迅速降解还有一些蛋白则由于结构复杂、跨膜区域或翻译后修饰需求不适合当前宿主。低表达的分析需要从基因到最终可回收蛋白逐级判断。一、重组蛋白表达量的主要影响因素重组蛋白的最终产量并不是单一环节决定的结果。从目标基因进入宿主细胞开始需要依次经历转录、mRNA稳定、翻译、蛋白折叠、定位以及细胞内稳定等过程。任何一个环节受到限制都可能表现为最终获得的目的蛋白量不足。基因转录水平较高并不代表一定能够获得高蛋白表达。mRNA本身的稳定性以及5′端局部二级结构会影响核糖体结合和翻译起始编码区的密码子组成还可能影响翻译延伸速度以及新生肽链的折叠。相关研究表明基因的核苷酸组成、密码子选择以及调控区域的序列均能够影响异源蛋白表达水平。蛋白合成之后还存在折叠和稳定性问题。目标蛋白如果不能及时形成正确构象可能发生聚集、形成包涵体或者被宿主细胞的蛋白质质量控制系统识别并降解。此时即使目标基因具有较高的转录和翻译水平最终获得的可溶性蛋白仍然可能很少。所以实际分析时需要区分“表达量低”和“可回收蛋白量低”。前者主要涉及基因表达本身后者还包括折叠、溶解性、稳定性和降解等因素。二、基因与表达载体影响蛋白表达目标基因的序列特征是影响重组蛋白表达的重要因素之一。不同物种之间存在明显的密码子使用偏好来源于真核生物或其他物种的基因在大肠杆菌中表达时如果编码序列包含较多宿主低频使用密码子可能影响翻译过程严重时会造成核糖体停顿、翻译效率下降甚至出现异常或截短蛋白。但密码子问题不能简单理解成“稀有密码子越少越好”。密码子选择与mRNA二级结构、翻译起始和翻译延伸之间存在相互作用。尤其是起始密码子附近的序列如果形成过于稳定的局部结构可能影响核糖体对mRNA的识别。另一方面翻译速度本身也会影响新生肽链的折叠过程单纯追求最大化翻译速度并不一定能够获得更多正确折叠的蛋白。表达载体同样决定了目标基因能够以什么样的强度和方式被表达。启动子、转录调控元件、5′UTR、核糖体结合区域、载体拷贝数以及目标基因与载体之间的序列连接都可能影响最终产量。对于某些蛋白过强的表达反而会增加细胞代谢负担使蛋白合成速度超过宿主的折叠和质量控制能力最终形成更多聚集蛋白。针对基因和载体因素通常需要从目标序列、宿主密码子偏好、mRNA结构以及表达调控强度进行整体评估。对于已经确认目标基因本身没有问题的情况更换表达载体或调整表达调控方式有时比单纯提高表达强度更加有效。三、宿主细胞与表达系统影响蛋白产量不同宿主细胞具有不同的蛋白合成、折叠和加工能力。大肠杆菌具有生长速度快、培养成本低和表达体系成熟等特点适合许多结构相对简单、无需复杂翻译后修饰的重组蛋白。但其胞质环境与真核细胞存在明显差异对于部分需要二硫键形成、糖基化或其他翻译后修饰的蛋白并不一定能够提供合适的折叠和加工环境。目标蛋白的结构特点决定了这种差异是否会转化为明显的表达差距。含有多个二硫键的蛋白需要适合的氧化环境完成正确折叠膜蛋白含有明显疏水区域表达后需要正确定位到膜结构部分复杂真核蛋白则依赖特定的翻译后修饰和细胞内加工过程。如果这些条件与宿主的生物学环境不匹配即使载体本身具有较强的表达能力也可能出现低表达或大量不可溶蛋白。酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞能够提供不同程度的真核蛋白加工能力在复杂蛋白、分泌蛋白和部分翻译后修饰依赖型蛋白的表达中具有不同适用范围。表达系统的选择实际上是目标蛋白结构需求与宿主细胞能力之间的匹配问题而不是简单比较哪一种体系“表达量最高”。宿主细胞状态也会影响最终产量。部分目标蛋白具有明显的细胞毒性或者大量表达会造成膜系统、代谢过程和蛋白质稳态受到干扰。持续的表达压力可能降低宿主生长状态甚至造成表达载体不稳定使最终检测到的目标蛋白量下降。四、蛋白结构与细胞内稳定性影响表达水平目标蛋白自身的结构是低表达问题中容易被忽略的一环。不同蛋白的折叠难度差异很大单结构域、小分子量、结构相对稳定的蛋白通常更容易获得可溶性表达而多结构域蛋白、膜蛋白、富含疏水区域的蛋白以及部分无序蛋白更容易发生错误折叠和聚集。在大肠杆菌等体系中当目标蛋白合成速度超过细胞折叠和质量控制能力时新生肽链可能暴露疏水区域并相互作用最终形成包涵体。此时检测总蛋白可能发现目的蛋白表达明显但真正存在于可溶性组分中的蛋白却很少。包涵体形成与正确折叠、聚集和蛋白降解之间存在动态平衡因此“有条带”并不能直接等同于“获得了足量的可用蛋白”。蛋白降解同样可能造成低表达。部分目标蛋白结构不稳定或者含有容易暴露的柔性区域在宿主细胞中可能迅速受到蛋白酶作用。此时实验结果往往表现为完整目的蛋白较少同时伴随多个低分子量降解条带。重组蛋白表达过程中错误折叠、聚集和蛋白水解都可能成为限制最终产量的重要因素。对于含有复杂二硫键结构的蛋白这一问题更加明显。大肠杆菌胞质属于相对还原性的环境部分需要二硫键才能形成正确结构的蛋白在胞质中容易出现错误折叠或聚集。因此看到“表达量低”时应进一步判断目标蛋白究竟是没有充分合成还是合成后主要进入了不可溶组分或者在细胞内发生了快速降解。三种情况对应的解决方向完全不同。#重组蛋白#蛋白表达#蛋白表达量#重组蛋白表达#蛋白表达系统#蛋白可溶性#蛋白纯化#表达量优化#
